Tugas Resuman
PSDH
Nama : PitrianaPSDH
NIM : J1C108042
Prodi : biologi
“Glycine N-methyltransferase Merupakan Contoh dari Fungsional Diversity Yang
Berperan Sebagai Polycyclic Hidrokarbon Aromatik Yang Mengikat Reseptor”
Berperan Sebagai Polycyclic Hidrokarbon Aromatik Yang Mengikat Reseptor”
Gen sitokrom dapat diatur oleh beberapa faktor termasuk Polycyclic Aromatik Hidrokarbon (PAH) dari protein, ini diidentifikasikan sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT). Peran GNMT sebagai PAH yaitu dapat mengikat protein dan menginduksi sitokrom yang telah diselidiki lebih lanjut. GNMT cDNA melakukan proses kloning ke dalam vektor pMAMneo yang berisi Rous sarcoma virus promotor dan gen resistensi neomisin, yang secara stabil mentarnfer ke indung sel telur hamster.
Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) seperti 3 methylcholanthrene dan TCDD adalah polusi lingkungan yang mendatangkan berbagai beracun, teratogenik, dan karsinogenik terhadap hewan. Selain itu, bahan ini sangat ampuh reaksi tertentu yang dikatalisis oleh sitokrom P-450 yang tergantung pada monooxygenases, yang terdiri dari isozymic hemoproteins lebih dari 12 kelompok gen. Isozymes ini merupakan substrat kekhususan dan memetabolisme substrat endogen baik untuk elektrofilik derivative. Beberapa di antaranya dapat berinteraksi dengan DNA, sehingga berpotensi mengaktifkan protokogenes atau menonaktifkan gen supresor tumor.
GNMT pertama kali ditemukan dalam ekstrak hati dan terlibat dalam oksidasi metil karbon dari metionin, meskipun jalur ini account hanya 20% dari total metil metabolisme metionin. Kemudian, Kerr (35) menyatakan bahwa enzim berperan dalam pengturan tingkat relatif S-adenosylmethionine dan S-adenosylhomocysteine dalam sel. Dalam sebuah studi berikutnya Cook danWagner (41), menerangkan bahwa GNMT ditunjukkan bertindak sebagai protein folat dalam sitosol dari hati tikus. Tikus GNMT, dalam enzimatik yang berperan adalah homotetramer terdiri dari 33-kDa subunit, yang tersedia situs mengikat independen untuk S-adenosylmethionine, glisin, dan folat.
Bentuk enzimatik GNMT, yaitu homotetramer, tidak aktif sebagai binding protein, dan monomer tidak dapat berfungsi baik enzimatik atau sebagai pengikat. Bukti permulaan menunjukkan homodimer sebagai fungsional mengikat 2 unit CDNA untuk GNMT yang telah terisolasi.
GNMT pertama kali ditemukan dalam ekstrak hati dan terlibat dalam oksidasi metil karbon dari metionin, meskipun jalur ini account hanya 20% dari total metil metabolisme metionin. Kemudian, Kerr (35) menyatakan bahwa enzim berperan dalam pengturan tingkat relatif S-adenosylmethionine dan S-adenosylhomocysteine dalam sel. Dalam sebuah studi berikutnya Cook danWagner (41), menerangkan bahwa GNMT ditunjukkan bertindak sebagai protein folat dalam sitosol dari hati tikus. Tikus GNMT, dalam enzimatik yang berperan adalah homotetramer terdiri dari 33-kDa subunit, yang tersedia situs mengikat independen untuk S-adenosylmethionine, glisin, dan folat.
Bentuk enzimatik GNMT, yaitu homotetramer, tidak aktif sebagai binding protein, dan monomer tidak dapat berfungsi baik enzimatik atau sebagai pengikat. Bukti permulaan menunjukkan homodimer sebagai fungsional mengikat 2 unit CDNA untuk GNMT yang telah terisolasi.
- BAHAN DAN METODE
Medium kimia dari kultur jaringan, yang merupakan minimal medium penting, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofektin itu dari teknologi, sumber bahan lain adalah: [a-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine, CA), (60 Ci / mmol) dari Amersham Corp, [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS), Immobilon P dari Millipore (Bedford, MA), S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH), BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Biochemica Boehringer Mannheim Corp (Indianapolis, IN), Tris, TEMED, Tween 20, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma.
Afinitas dimurnikan dengan antibodi terhadap Ah GNMT dan reseptor itu dari Dr Conrad Wagner (Vanderbilt University) dan Dr Bill Greenlee (University of Massachusetts Medical Center), masing-masing. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA itu baik disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin).
MK onstruksi plasmid dan transfection, GNMT cDNA ini disintesis dengan RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) 1 RNA persiapan. GNMT spesifik yang maju dan bersifat primer strukturnya adalah 59-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGAC dan 59-TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing produk berikutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan dengan GNMT cDNA. Dua situs kloning untuk NheI dan XhoI dimasukkan ke dalam daerah noncoding dari GNMT cDNA oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI kemudian dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid bersifat membangun, pMAMneo / GNMT, yang berisi GNMT dimasukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi yang ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan. pMAMneo / GNMT mentransfer CHO ke sel oleh Lipofectin metode.
Sitoplasma dapat dipisahkan dengan sentrifugasi 10.000 3 g pada suhu 4°C. Total selular protein yang telah ditambahkan pada SDS-8% Polyacrylamide gel elektroforesis, dan protein dipindahkan ke Immobilon P membran yang menggunakan Bio-Rad. Selaput didiamkan selama 1 jam dalam kondisi 5% kering tanpa lemak susu dalam Tris-garam, pH 7.5, dan diinkubasi semalam dengan antibodi primer yang tepat, diikuti dengan inkubasi selama 1 jam dengan antibodi sekunder terkait dengan peroksidase.
Total RNA sampel (40 mg) yang didenaturasi dengan pemanasan pada suhu 65°C selama 15 menit di 50% (v / v) formamide, 2.2 M formaldehida, 0,53 buffer dan fraksi melalui elektroforesis dengan gel yang mengandung formalin 1,5% agarosa. Sampel RNA ditransfer untuk Nytran selaput (Schleicher & Schuell) di 10 SSPE, prehybridized, dan hibridisasi dengan menggunakan berbagai DNA yang berlabel untuk aktivitas tertentu ,108 cpm / mg DNA dengan dATP menggunakan metode primer acak.
Secara singkat, sel-sel dihentikan dalam 10 mM HEPES, pH 7.5, selama 15 menit, sentrifugal, resuspen dalam 1 sel volume pelet tidur (25 HEPES mM, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol) dan gangguan di Dounce Homogenizer. Setelah sentrifugasi dalam proses pendinginan 10 menit pada 14.000 g, pelet nuklir itu resuspen dalam 1 sel pelet volume ranjang, 0.4 M KCl pada 4°C selama 30 menit. Setelah homogenisasi dalam Dounce ketat aparat, gliserol ini ditambahkan dengan konsentrasi akhir 20% (v / v). Fraction nuklir diperoleh oleh sentrifugasi pada 180.000 g selama 30 menit pada 4°C, dan 32P-label yang beruntai ganda oligonukleotida sintetik, yang berisi XRE1 21.003-2.977 pasangan basa dari CYP1A1 sel tikus.
- HASIL
Sel CHO dipilih sebagai target untuk transformasi karena kurangnya ekspresi gen endogen dan efisiensi GNMT transfection dengan pMAMneo / GNMT menggunakan Lipofectin teknik. 35 neomisin-klon resisten secara acak dipilih, terisolasi, dan tumbuh menjadi budaya massa untuk karakterisasi lebih lanjut. Penyaringan awal dilakukan oleh RT-PCR analisis dari klon G418. Hanya CHO-GNMT sel (di samping hati RNA) ditunjukkan yang benar 4 S transkip.
Analisis RT-PCR dan b-aktin transkrip dari Sel CHO. Total selular RNA (0,5 mg) telah ditaklukkan kepada RT-PCR analisis selama 35 siklus dalam total volume 50 ml. 10 ml sampel reaksi dari CHO, CHO-neo dan CHOGNMT sel ini dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa.
RNA yang telah ditransfer untuk nitroselulosa membran ini secara bersamaan diselidiki dengan CYP1A1 dan b-aktin cDNA. Hanya 3-methylcholanthrene yang dapat menimbulkan CYP1A1 positif mRNA. TCDD mewakili prototypic ligan untuk reseptor Ah, itu tidak efektif dalam mendorong CYP1A1 di GNMT CHO sel, b-Napthoflavone juga tidak efektif dalam mendorong CYP1A1 dalam sel-sel ini. Ekspresi CYP1A1 Protein dan EROD diinduksi, CHO-neo, dan GNMT CHO sel dan dianalisis pada gel SDS untuk CYP1A1 protein..
Ah reseptor pada aktivitas GMSA untuk XRE1 adalah dicirikan dengan protein yang berpartisipasi dalam dioxin-dimediasi induksi CYP1A1 dengan cara mengikat XREs terkait dengan CYP1A1.Pembentukan reseptor XRE Ah rumit dibuktikan dengan ekstrak nuklir yang dibuat dari HEPA-1 sel yang telah diperlakukan dengan TCDD.
- DISKUSI
PAH 4 S protein diidentifikasi sebagai GNMT pada dasarnya dari beberapa kriteria, termasuk pemurnian, pengurutan, immunoprecipitation dari PAH aktivitas mengikat antibodi poliklonal untuk GNMT, dan copurification dari dua protein dalam
berbagai sel dan jaringan.
Penelitian ini dirancang untuk memperkenalkan GNMT gen ke dalam sel yang tidak memiliki kemampuan untuk mengekspresikan protein serta reseptor Ah. Sel-sel ini kemudian akan menyediakan model biologis yang cocok untuk menguji induksi oleh PAHs seperti 3-methylcholanthrene. Hasil studi ini memberikan informasi langsung peran fungsional sebagai GNMT PAH protein yang dapat menengahi induksi CYP1A1. .
Fosforilasi yang terlibat dalam menstabilkan PAH mengikat bentuk (dimer) dari protein. Akibatnya, tingkat itu membatasi faktor dalam menentukan jumlah transkripsional fungsional penggerak yaitu keadaan fosforilasi dalam bentuk dimer GNMT dan konsentrasi intraselular PAH. Jumlah homotetramer, yaitu bentuk utama GNMT yang relevan.
Afinitas dimurnikan dengan antibodi terhadap Ah GNMT dan reseptor itu dari Dr Conrad Wagner (Vanderbilt University) dan Dr Bill Greenlee (University of Massachusetts Medical Center), masing-masing. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA itu baik disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin).
MK onstruksi plasmid dan transfection, GNMT cDNA ini disintesis dengan RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) 1 RNA persiapan. GNMT spesifik yang maju dan bersifat primer strukturnya adalah 59-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGAC dan 59-TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing produk berikutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan dengan GNMT cDNA. Dua situs kloning untuk NheI dan XhoI dimasukkan ke dalam daerah noncoding dari GNMT cDNA oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI kemudian dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid bersifat membangun, pMAMneo / GNMT, yang berisi GNMT dimasukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi yang ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan. pMAMneo / GNMT mentransfer CHO ke sel oleh Lipofectin metode.
Sitoplasma dapat dipisahkan dengan sentrifugasi 10.000 3 g pada suhu 4°C. Total selular protein yang telah ditambahkan pada SDS-8% Polyacrylamide gel elektroforesis, dan protein dipindahkan ke Immobilon P membran yang menggunakan Bio-Rad. Selaput didiamkan selama 1 jam dalam kondisi 5% kering tanpa lemak susu dalam Tris-garam, pH 7.5, dan diinkubasi semalam dengan antibodi primer yang tepat, diikuti dengan inkubasi selama 1 jam dengan antibodi sekunder terkait dengan peroksidase.
Total RNA sampel (40 mg) yang didenaturasi dengan pemanasan pada suhu 65°C selama 15 menit di 50% (v / v) formamide, 2.2 M formaldehida, 0,53 buffer dan fraksi melalui elektroforesis dengan gel yang mengandung formalin 1,5% agarosa. Sampel RNA ditransfer untuk Nytran selaput (Schleicher & Schuell) di 10 SSPE, prehybridized, dan hibridisasi dengan menggunakan berbagai DNA yang berlabel untuk aktivitas tertentu ,108 cpm / mg DNA dengan dATP menggunakan metode primer acak.
Secara singkat, sel-sel dihentikan dalam 10 mM HEPES, pH 7.5, selama 15 menit, sentrifugal, resuspen dalam 1 sel volume pelet tidur (25 HEPES mM, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol) dan gangguan di Dounce Homogenizer. Setelah sentrifugasi dalam proses pendinginan 10 menit pada 14.000 g, pelet nuklir itu resuspen dalam 1 sel pelet volume ranjang, 0.4 M KCl pada 4°C selama 30 menit. Setelah homogenisasi dalam Dounce ketat aparat, gliserol ini ditambahkan dengan konsentrasi akhir 20% (v / v). Fraction nuklir diperoleh oleh sentrifugasi pada 180.000 g selama 30 menit pada 4°C, dan 32P-label yang beruntai ganda oligonukleotida sintetik, yang berisi XRE1 21.003-2.977 pasangan basa dari CYP1A1 sel tikus.
- HASIL
Sel CHO dipilih sebagai target untuk transformasi karena kurangnya ekspresi gen endogen dan efisiensi GNMT transfection dengan pMAMneo / GNMT menggunakan Lipofectin teknik. 35 neomisin-klon resisten secara acak dipilih, terisolasi, dan tumbuh menjadi budaya massa untuk karakterisasi lebih lanjut. Penyaringan awal dilakukan oleh RT-PCR analisis dari klon G418. Hanya CHO-GNMT sel (di samping hati RNA) ditunjukkan yang benar 4 S transkip.
Analisis RT-PCR dan b-aktin transkrip dari Sel CHO. Total selular RNA (0,5 mg) telah ditaklukkan kepada RT-PCR analisis selama 35 siklus dalam total volume 50 ml. 10 ml sampel reaksi dari CHO, CHO-neo dan CHOGNMT sel ini dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa.
RNA yang telah ditransfer untuk nitroselulosa membran ini secara bersamaan diselidiki dengan CYP1A1 dan b-aktin cDNA. Hanya 3-methylcholanthrene yang dapat menimbulkan CYP1A1 positif mRNA. TCDD mewakili prototypic ligan untuk reseptor Ah, itu tidak efektif dalam mendorong CYP1A1 di GNMT CHO sel, b-Napthoflavone juga tidak efektif dalam mendorong CYP1A1 dalam sel-sel ini. Ekspresi CYP1A1 Protein dan EROD diinduksi, CHO-neo, dan GNMT CHO sel dan dianalisis pada gel SDS untuk CYP1A1 protein..
Ah reseptor pada aktivitas GMSA untuk XRE1 adalah dicirikan dengan protein yang berpartisipasi dalam dioxin-dimediasi induksi CYP1A1 dengan cara mengikat XREs terkait dengan CYP1A1.Pembentukan reseptor XRE Ah rumit dibuktikan dengan ekstrak nuklir yang dibuat dari HEPA-1 sel yang telah diperlakukan dengan TCDD.
- DISKUSI
PAH 4 S protein diidentifikasi sebagai GNMT pada dasarnya dari beberapa kriteria, termasuk pemurnian, pengurutan, immunoprecipitation dari PAH aktivitas mengikat antibodi poliklonal untuk GNMT, dan copurification dari dua protein dalam
berbagai sel dan jaringan.
Penelitian ini dirancang untuk memperkenalkan GNMT gen ke dalam sel yang tidak memiliki kemampuan untuk mengekspresikan protein serta reseptor Ah. Sel-sel ini kemudian akan menyediakan model biologis yang cocok untuk menguji induksi oleh PAHs seperti 3-methylcholanthrene. Hasil studi ini memberikan informasi langsung peran fungsional sebagai GNMT PAH protein yang dapat menengahi induksi CYP1A1. .
Fosforilasi yang terlibat dalam menstabilkan PAH mengikat bentuk (dimer) dari protein. Akibatnya, tingkat itu membatasi faktor dalam menentukan jumlah transkripsional fungsional penggerak yaitu keadaan fosforilasi dalam bentuk dimer GNMT dan konsentrasi intraselular PAH. Jumlah homotetramer, yaitu bentuk utama GNMT yang relevan.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar